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彩页印刷 2023-06-03 13:00 680

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没有ct值

检测成果碰到没有Ct值情况,排查能否有以下问题:

1、轮回数不敷(一般不超越* * 轮回,不只布景值进步,定量也禁绝);

2、PCR法式设置错误,检测荧光信号的步调有误。一般SG法接纳72℃延伸时收罗,TaqMan法例一般在退火完毕时或延伸时收罗信号,别的荧光收罗能否选中;

* 、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针能否降解;

* 、模板量可能降解或上样量不敷(不超越* 00ng,按照试剂盒申明书即可),对未知浓度的样本应从系列稀释样本的更高浓度做起;若是发作模板降解,应考虑样本筹办中杂量的引入及频频冻融的情况,建议将模板样本小量分拆储蓄,制止频频冻融;

* 、引物探针能否适宜(尤其是引物逾越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下流引物Tm值超越* ℃以上也会影响扩增)。

尺度曲线欠安

尺度曲线线性关系欠安R20.9),很有可能是以下环节存在问题:

1、尺度品稀释或者加样误差,使得尺度品不呈梯度;

2、尺度品呈现降解。应制止尺度品频频冻融,将高浓度DNA模板分拆,保留于-20℃或-* 0℃,现配现用;

* 、引物或探针欠安。从头设想更好更不变的引物或探针;

* 、模板中存在按捺物。模板浓渡过高,按照现有商品化荧光定量试剂盒的要求,一般模板量以* 0—* 00ng为宜。

ct值过晚

在相对定量中,Ct值一般控造在1* —2* 之间比力好,若是在绝对定量中,对低拷贝数的样品,Ct值会增大,但是一般不宜超越* 0轮回,不然定量禁绝确。因而,判断Ct值呈现过晚能否属于非一般情况,需要按照详细尝试设想和目标停止。

1、 扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不适宜,需要停止优化;引物或探针设想不合理,需要从头设想;

2、PCR法式不适宜,改用三步法停止反响,或者优化退火/延伸温度,能够恰当降低退火温度;退火/延伸时间短(能够在保举的时间前提下耽误10s);

* 、MgCl2 浓度不适宜,增加镁离子浓度等。PCR各类反响成分的降解或加样量的不敷;

* 、PCR产品太长。PCR产品设想超越* 00bp;

* 、模板中存在按捺物。用高纯度模板停止PCR检测或将模板停止稀释。

熔解曲线峰不特异

熔解曲线峰不特异很有可能是以下环节存在问题:

1、引物设想不敷优化。应制止引物二聚体和发夹构造的呈现;引物浓度欠安,尤其是涉及二聚体存在时,恰当降低引物浓度,并留意上下流引物的浓度比例;

2、模板有基因组污染。RNA提取过程中制止基因组DNA的引入,或通过引物设想制止非特异性扩增。

* 、离子浓度不适宜。恰当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒,差别试剂盒在该方面的优化才能不合适,有些情况下能够通过改换试剂盒改善成果;

阴性对照扩增有信号

照扩增有信号排查各操做环节能否有不妥,形成穿插污染:

1、引物设想不敷优化。应制止引物二聚体和发夹构造的呈现。

2、引物浓度欠安。恰当降低引物浓度,并留意上下流引物的浓度配比。

* 、镁离子浓渡过高。恰当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒。

* 、模板有基因组的污染。RNA提取过程中制止基因组DNA的引入,或通过引物设想制止非特异性扩增。

* 、穿插污染。在所用的试剂中有穿插污染,或操做情况中有气溶胶形成污染,建议对操做情况停止处置,或者改换新的情况、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。

扩增曲线异常

碰到扩增曲线异常,好比“S”型曲线等等情况,有可能是以下环节存在问题:

1、模板的浓度太高或者降解;

2、荧光染料的降解;

* 、在操做荧光定量PCR时,带上新的一次性手套,盖上制止任何指纹或者笔迹等;

* 、液体挥发。耗材气密性等问题引起液体蒸发,没有很好的聚集在管子里;

* 、气泡。操做问题如移液枪加样引起的气泡问题。

扩增效率低

该情况适用于针对所有的基因,出格是内参基因仍无法获得较好的扩增信号时,应考虑如下情况:

1、反响试剂中部门成分比例能否更佳,别的考虑荧光染料能否降解;

2、反响前提不敷优化。可恰当降低退火温度或改为三步扩增法,恰当耽误变性退火时间;

* 、反响系统中有PCR反响按捺物。一般是参加模板时所引入的,应先把模板适度稀释,再参加反响系统,削减按捺物的影响。

来源:临床尝试室

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